摘 要：以低糖酵母发酵过程为研究对象，对发酵过程中的生理参数呼吸商（RQ）、二氧化碳释放速率（CER）和氧气吸收速率（OUR）等参数变化进行了检测和分析。以RQ值作为主要在线指导参数，通过耦合RQ优化发酵过程中的碳源流加速率，使得低糖酵母干物质总量由1 125 g提高到了1 650 g。通过这种优化控制生理参数RQ的方法实现了低糖酵母发酵过程的优化，有效提高了低糖酵母的发酵产量。
关键词：低糖酵母；活力；呼吸商（RQ）；二氧化碳释放速率（CER）；氧气吸收速率（OUR）
中图分类号：S963.32+7 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.10.005
Optimization of Lean Dough Yeast Fermentation based on Physiological Parameters
CHENG Ben1， LI Xiao1，2， XU Chaoqun2， HUANG Cong2， LI Jianhua2， ZHENG Nian2， LI Yong2，TAN Yali2， KUANG Jinbao2
（1. College of Biological and Pharmaccutical， China Three Gorges University， Yichang， Hubei 443003， China； 2. Angel Yeast Limited Company， Yichang， Hubei 443003， China； 3. Angel Yeast Yili Limited Company， Yili， Xinjiang 835000， China）
Abstract： This paper was focused on the study of lean dough yeast fermentation， and the relationship of the parameters such as respitatory quotient （RQ）， carbon dioxide evolution rate （CER） and oxygen uptake rate （OUR） were detected and analyzed in the course of fermentation. RQ was utilized as the main online guidance parameter， the total dry matter increased from 1 125 g to 1 650 g through optimizing the adding rate of carbon source coupled with RQ. Therefore， through analyzing and optimizing RQ value， the fermentation yield of lean dough yeast was improved effectively.
Key words： lean dough yeast； fermentative activity； respitatory quotient （RQ）； carbon dioxide evolution rate （CER）； oxygen uptake rate （OUR）
在酵母菌的高密度发酵过程中，为了获得较高的生物量，需要投入大量的基质用于菌体生长和产物合成。由于低糖酵母存在Crabtree效应，当培养基中的糖浓度高于一定值时葡萄糖会溢流代谢生成乙醇，影响酵母菌的得率[1]。
补料分批发酵又可称为流加发酵（Fed-Batch fermention），是一种介于分批发酵和连续发酵之间的特殊培养模式[2]，它是在分批发酵过程中连续或间歇地向发酵罐中流加一种或几种限制性底物，直到发酵结束后才放出培养液的一种操作方式。流加培养的方式可分为恒速流加、指数流加和反馈流加等。因为流加发酵可以有效延长细胞对数生长期和稳定期的维持时间，并且增加生物量和代谢产物的积累，所以发酵工业中大多采用这种发酵方式进行生产[3]。
发酵工业的发展研究表明，停留在以反应器尺度参数（ pH值、溶氧、底物濃度、温度、转速、通气量等） 调控上的优化及放大工艺研究存在很大的技术局限性。在微生物发酵过程中，从微观代谢的角度了解细胞内部代谢物质流情况，并对整个发酵过程进行有效及时的工艺调控是非常重要的。通过工艺的调整来维持发酵过程中合适的RQ值，就能够很好地控制发酵过程中微观代谢途径通量的变化，促进产物的产率和底物转化率的提高，最大限度地减少副产物的积累，提高发酵水平[4]。
本研究课题的试验是在安琪酵母有限公司完成的，是在公司提供的原始流加方案基础上进行的优化试验。发酵罐总体积50 L，有效利用体积为60%左右。为得到较高生物量的酵母菌体，采用流加方式，流加碳源、氮源和磷源。发酵过程中控制酒精含量，一般控制在0%～0.5%（v/v）左右，通过调节风量和流加量来控制酒精含量，使酵母有较高的得率。
1 材料和方法
1.1 试验材料
（1）菌种。低糖酵母，由安琪酵母股份有限公司菌种室提供。
（2）试剂。重铬酸钾，浓硫酸，碘化钾，可溶性淀粉，氢氧化钠，硫代硫酸钠，无水乙醇，95%乙醇，六水合氯化镁，氯化锌。以上试剂均为分析纯AR，购自国药集团化学试剂北京有限公司。
（3）主要仪器与设备。ZHWY-211D脚踏开门型大容量全温度恒温摇床，上海智城生物科技有限公司；FUS-50L（A）型新概念发酵罐，上海国强生化工程装备有限公司；PAS7000型生物尾气分析仪，重庆哈特曼科技有限公司；TDL-60B型飞鸽牌系列离心机，上海安亭科学仪器厂制造；pH计，梅特勒-托利多集团；卧式灭菌锅，上海医用核子公司。
（4）培养基。一级、二级种子培养基：YPD培养基，1% 酵母抽提物（FM888），2%蛋白胨（FM318），2%葡萄糖（glucose）。50 L发酵罐培养基：底水18 L。流加培养基：糖蜜140 Brix 糖蜜（即 100 mL 含糖 28 g）约为 10 L 左右；氨水约为 720 mL；磷酸二氢氨为68 g，将磷源溶于600 mL 水中；氯化镁20 g氯化锌5 g溶于600 mL水中。除氨水外，其余均在115 ℃条件下灭菌30 min。
1.2 试验方法
（1）一级种子液制备。取一支制备好的甘油管，接入装有200 mL YPD培养液的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r·min-1下36 h。
（2）二级种子液制备。将一级种子液全部接入装有1 000 mL YPD培养基的2 L摇瓶中，28 ℃、180 r·min-1下36 h。
（3）50 L罐发酵试验。将培养好的二级种子接入到发酵罐中。发酵罐总体积50 L，有效利用体积约为60%，因发酵过程中泡沫较多，设计发酵体积为30 L，为了得到较高的生物量，采用流加方式（流加程序见表1）。发酵罐中只有底水，碳源、氮磷源都是流加进去。发酵过程中通过控制转速、风量和碳源的流加速度，来控制酒精含量。同时，可通过酒精的含量来反馈调节碳源的流加速度。
（4）马丁试验检测发酵液中酒精含量。空白试验：准确移取0.05 mol·L-1酸性重铬酸钾溶液10.0 mL于球形接收器中，用10 mL量筒取10.0 mL、0.06 g·L-1氢氧化钠溶液倒入隔离管中，连接好仪器，加热蒸馏，以沸腾起记时，蒸馏5 min，停止蒸馏。用少量蒸馏水冲洗连接管口，取下接收器，迅速冷却至室温，倒入250 mL三角瓶中，用约100 mL水分3次冲洗接收器，冲洗液一并倒入三角瓶中，加2 mL碘化钾溶液及1 mL淀粉指示液，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至绿色即为终点。
试样中乙醇含量按下式计算：
X=■
式中：X为试样中乙醇的百分含量，%；C为硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol·L-1；V1为空白试验消耗硫代硫酸钠标准溶液的量，mL；V2为试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的量，mL；V3为吸取试样的体积，mL；0.0146∶1.00 mL 硫代硫酸钠标准溶液（ 1.0 mol·L-1）相当于乙醇的量；N为稀释倍数。
（5）发酵糖、氮磷源流加量计算。糖流加量：发酵液总体积30 L，设定酵母细胞生物量220 g·L-1 （含25%干物质），则折合成干酵母1 650 g，按照糖对酵母转化率60%计算则需要糖2 750 g，折合成40 Brix糖蜜（即100 mL含糖28 g）约为10 L左右；配置浓度为28%的葡萄糖溶液10 L作为另外方案的碳源。氮流加量：设定干酵母含蛋白质48% （工业发酵平均值），则需要N 126.72氮元素。试验中，氮元素主要由氨水（氮元素含量为0.175 g·mL-1 ）提供，需要氨水约为720 mL。磷流加量：设定干酵母含五氧化二磷2.5%，则需要五氧化二磷41.25 g，折合磷酸二氢氨为68 g，将磷源溶于680 mL水中。糖蜜、磷源、流加瓶、硅胶管均以115 ℃，30 min灭菌处理。
（6）流加发酵程序。原始流加方案，对流加发酵程序设定值如表1所示。
2 结果与分析
2.1 原始方案发酵过程的溶氧分析
碳源是构成酵母细胞碳架及能量的来源，碳源的流加速度直接影响细胞的增值速度。因为刚开始发酵罐中只有底水，所以在种子接入后，开始按照上表的流加程序流加碳、氮、磷源。发酵液中如果酒精含量过高，就会一直生长酵母，同时降低碳源转化率，因此，控制发酵过程中酒精含量极为重要。由于克雷布效应的存在，即使这时发酵液中氧气充足，当碳源添加过快时，也会产生乙醇。因此，在发酵过程中需要每个小时都检测酒精含量。当糖蜜作流加碳源时，取5次试验的平均值，低糖酵母细胞生长情况如图1所示。可以从图1中看到，利用糖蜜进行低糖酵母发酵，其生理参数的变化，包括溶解氧Dissolved oxygen （DO）；氧吸收速率Oxygen uptake rate （OUR）；二氧化碳释放速率Carbon dioxide evolution rate （CER）；作出糖蜜、氨水流加速率以及pH变化。为了避免葡萄糖的巴斯德效应（氧抑制作用）和Crabtree效应（葡萄糖对氧化呼吸链的抑制作用[5]）对细胞生长的影响以及减少副产物乙醇的产生，选择合理的糖蜜流加策略成为低糖酵母高密度發酵的关键，因此，试验采用了基于实时参数呼吸商（Respiratory quotient， RQ）和酒精浓度调控的糖蜜补料策略。
从图1中还可以看到，溶氧在发酵初期下降并不迅速，从5 h开始大幅度降低。随着不断进行糖蜜的流加发酵，发酵罐中的溶解氧逐渐降低，直到14 h基本为0。前期溶氧下降很慢，湿重增加很少，酵母生长缓慢。主要原因可能是碳源、氮源补充不足，或者是接种量、种龄等造成的延迟期过长。5 h后溶氧大幅度降低，这是因为酵母利用碳源进行代谢作用，需要大量消耗氧气。这说明5 h后酵母代谢旺盛，湿重较之前有所上升。在整个发酵过程中，溶氧不断下降，只到发酵结束降为0，说明在此次发酵过程中，酵母一直处于代谢加强的过程，耗氧量不断增大。
2.2 原始方案发酵过程生物量的变化分析
在发酵初期，生物量增长缓慢，细胞处于延迟期，合成新的酶系以适应环境[6]。在5 h以后酵母开始快速增长，生物量急剧上升，可以看到在0～9 h，酒精浓度处于极低的水平，说明在发酵过程中，溶氧充足，同时因为无氧呼吸所生成的酒精含量极少，因此未能造成酒精的积累。在第9 h后，糖蜜流加速率继续增加，乙醇浓度升高，酵母仍快速生长，说明此时的酒精浓度并未抑制酵母的生长。乙醇浓度在增大后逐渐降低为0。此时，虽然碳源流加量有所增加，但是乙醇浓度仍在降低。乙醇产生量很少，说明在碳源控制上避免了Crabtree效应以及酵母的无氧呼吸作用。理论上，RQ值为1时，TCA通路被完全打开，葡萄糖经TCA通路完全转化为水和二氧化碳[7]。而当低糖酵母利用乙醇进行有氧代谢时，RQ为0.67，当RQ值低于1时，也说明此时酵母在利用乙醇作为碳源进行代谢，说明了碳源不充足。
发酵过程的重要生理参数OUR和CER很好地描述了酵母细胞的生长状况[8]。在发酵初期，酵母生长处于延迟期，呼吸作用较弱，因此OUR与CER均较低，随后两个值逐渐增大，说明酵母的有氧呼吸不断增强，同时生物量不断积累。可以发现，OUR、CER在糖蜜流加过程中保持着同步的增减，RQ在8 h前维持在0.8～0.9的范围内，可以看出酵母生长较为缓慢，随后RQ范围维持在0.9～1.0的范围，酵母湿重快速增长。
发酵过程通过pH值控制来调整发酵液中C/N比例。按照程序设定，pH值在发酵过程中呈逐渐上升，利用流加氨水来作为氮源[9]。可以看到在第4小时，pH值出现短暂的下降然后上升，此时的氨水流加速率基本恒定，说明了代谢过程有部分酸的积累，包括丙酮酸在内的各种有机酸在大量积累[10]，同时结合湿重变化情况可以看到，酵母湿质量在5 h后开始大量积累，产生大量代谢中间物。在11 h后流加氨水速率恒定，pH值出现先上升后恒定，说明了流加氨水的量在11 h并未被完全利用，有多余的NH4+离子可以保持pH值的上升，最后随着氨水流加停止，pH值迅速下降，这是因为酵母代谢生成的中间代谢物以及糖蜜等酸性物质的积累。
在原始方案中，最终发酵14 h，放罐体积约为30 L，最终湿质量为150 g·L-1，干物质含量约为25%，因此干物质总量约为1 125 g。
2.3 优化方案发酵过程的溶氧分析
通过上述分析，对流加方案中每个小时糖蜜流加速率进行调节，采用上述方法进行分析，多次试验后得到优化方案，利用优化方案也就是表2的方案进行流加发酵，取5次试验的平均值，做出低糖酵母的湿质量增长、酒精、CER、OUR、DO、RQ变化图（图2），并对其进行分析。
在发酵初始过程可以明显看到溶氧急剧下降，摄氧率增加，这是由于菌体开始代谢的结果[11]，如图2所示。随着不断地进行糖蜜的流加发酵，发酵罐中的溶解氧逐渐降低，直到6 h基本为0，这是由于酵母进入快速生长，大量进行有氧呼吸，因此发酵液中溶解氧快速降低到零。在6～14 h，溶解氧一直维持在0的状态，说明菌体的呼吸能力一直维持较强状态。
2.4 优化方案发酵过程生物量的变化分析
在发酵初期，生物量增长缓慢，细胞处于延迟期，合成新的酶系以适应环境。在3 h后酵母开始快速增长，生物量急剧上升，可以看到在0～3 h，酒精浓度在逐渐降低，说明初始种子液中含有部分酒精，在发酵初期被酵母作为碳源进行利用。随后糖蜜流加速率加快，乙醇浓度升高，酵母仍快速生长，说明此时的酒精浓度并未抑制酵母的生长。在8 h以后出現酒精浓度逐渐下降的情况，同时出现酵母的比生长速率降低，最大可能是碳源供应量不足导致的。随着碳源流加量的不断加大，酵母的湿质量不断增加，到第13 h达到最大值随后出现下降，此时主要是由于糖蜜流加量的减少以及停止流加氨水所致。对于利用糖蜜进行低糖酵母发酵，可以看到，在指数生长期，酵母生长迅速，当然这种迅速的生长依赖于对氧的大量消耗。在发酵过程中控制RQ在0.9～1.1的范围内，可以使得酒精含量在0.2%以下，全程并未出现酒精抑制酵母生长的现象，同时在发酵中也并未出现克雷布效应。
在发酵初期，酵母生长处于延迟期，呼吸作用较弱，因此OUR与CER均较低。随后两个值逐渐增大，说明酵母的有氧呼吸不断增强。同时，生物量不断积累，可以发现，OUR、CER在糖蜜流加过程中保持着同步的增减，RQ在整个对数生长期基本维持在0.9～1.1的范围，这也间接说明了在这个时期，酵母大量利用糖蜜中的可发酵性糖来进行有氧呼吸，因为利用葡萄糖完全进行有氧呼吸时RQ值为1。
发酵过程通过pH值控制来调整发酵液中C/N比例。按照程序设定，pH值在发酵过程中呈逐渐上升，利用流加氨水来作为氮源。在3 h前，氨水流加量较小，随着酵母的快速生长，氨水补加速率明显增加，NH4+浓度的增大会激活磷酸果糖激酶的活性、过量的丙酮酸积累、各种有机酸的产生，因此，氨水不断加入可以弥补pH值的降低。在7 h后，葡萄糖流加速率减缓，氨水补加速率恒定，生成有机酸的速率减缓，因此，溶液的pH值缓慢上升[12]。在13 h后，停止补加氨水，可以看到发酵液中pH值快速降低，说明酵母仍在代谢产生有机酸，但是由于氨水的停止加入，使得酵母生长速率降低，同时由于发酵液体积的增大，造成了最终发酵液中酵母湿质量的降低。
在优化后方案中，最终发酵14 h，放罐体积约为30 L，最终湿质量为220 g·L-1，干物质含量约为25%，因此干物质总量约为1 650 g。
3 结 论
本试验研究了对数期发酵过程中重要的生理学参数变化特征，其中RQ值的大小与发酵过程中酒精的含量高低具有高度相关性，这说明RQ值的变化代表了代谢途径的变化。发酵过程中糖蜜的流加量需要充足才能维持低糖酵母快速持续的增长。菌体在发酵过程中十分耗氧，并且菌体的生理学参数OUR与湿质量增长状况保持了良好的一致性。以糖蜜为碳源，控制RQ水平在0.9～1.1的范围内，可以控制全程酒精浓度在较低范围，并且最终酵母湿质量达到较高水平，发酵14 h后，湿质量可以达到220 g·L-1，折算成干物质总量为1 650 g，比原始方案提高了525 g。
参考文献：
[1]康远军. 高耐性鲁氏酵母高密度发酵研究[D]. 武汉：湖北工业大学， 2015.
[2]黄丽， 孙玉坤， 黄永红，等. 补料分批发酵过程控制系统研究[J]. 微计算机信息， 2006， 22（S9）：123-125.
[3]陈坚. 发酵工程实验技术[M]. 北京：化学工业出版社， 2013.
[4]ZENG A P， DECKWER W D. Bioreaction techniques under microaerobic conditions： From molecular level to pilot plant reactors[J]. Chemical engineering science， 1996， 51（10）：2305-2314.
[5]杭海峰， 叶新暤， 郭美锦，等. 以葡萄糖为生长相基质的重组毕赤酵母表达植酸酶发酵[J]. 工业微生物， 2009， 39（4）：12-16.
[6]高桦， 谭天伟. 影响酵母细胞麦角固醇的发酵控制参数的分析[J]. 生物工程学报， 2001， 17（6）：693-697.
[7]王萍， 王泽建， 张嗣良. 生理代谢参数RQ在指导发酵过程优化中的应用[J]. 中国生物工程杂志， 2013， 33（2）：88-95.
[8]张大伟. 微生物中生产辅酶Q_（10）的研究[D]. 北京：北京化工大学， 2007.
[9]刘健， 张伟平， 张恂，等. 重组植酸酶高表达与新型智能称量式补料装置的工业应用[J]. 中国抗生素杂志， 2009， 34（10）：602-605.
[10]尚飞. 酿酒酵母高密度发酵生产麦角固醇[D]. 北京：北京化工大学， 2006.
[11]张木. 麦角固醇发酵工艺的研究及优化[D]. 北京：北京化工大学， 2007.
[12]沈煜晖， 苏军划， 高惠华，等. 脱硫添加剂对湿法脱硫系统的影响[J]. 华电技术， 2012， 34（6）：67-69.